proGAT 是一个 ONT 原核基因组组装教程与分析脚本，主要用于演示从 Oxford Nanopore Technologies（ONT）长读长测序数据出发，完成原核生物基因组数据质控、基因组大小预测和基因组组装的基本流程。
本教程主要使用以下软件：
- SeqKit：测序数据基本统计
- fastplong：ONT 长读长数据过滤与质控
- LRGE：基因组大小预测
- Flye：长读长基因组组装
推荐结合 Conda 与 Docker 安装和管理上述分析软件，以减少软件依赖和环境配置问题。
ONT FASTQ
|
v
SeqKit
|
v
fastplong
|
v
LRGE
|
| estimated genome size
v
Flye
|
v
Assembly
其中，LRGE 预测得到的 genome size 会自动传递给 Flye 的：
--genome-size
参数，因此不需要手动设置预估基因组大小。
本教程可使用以下 NCBI SRA 数据作为 demo：
-
SRR23100672 https://trace.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/?view=run_browser&acc=SRR23100672&display=metadata
-
SRR23100674 https://trace.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/?view=run_browser&acc=SRR23100674&display=metadata
下载后的 ONT FASTQ 数据可放置于同一个输入目录中，例如：
datas/
├── SRR23100672.fastq.gz
└── SRR23100674.fastq.gz
每个 FASTQ 文件会被识别为一个独立样本。
推荐使用 Python 3：
python3 --version当前 proGAT.py 主要使用 Python 标准库，不需要额外安装 Python package。
推荐使用 Conda / Miniconda 管理本地命令行软件，例如：
conda create -n proGAT python=3.11
conda activate proGAT可以将 SeqKit、Flye、fastplong 等软件安装到独立的 proGAT 环境中。
安装完成后建议确认：
seqkit --version
flye --version
fastplong --version推荐使用 Docker 运行部分依赖较复杂的软件。
首先确认 Docker 可以正常使用：
docker --version使用 Docker 的优点包括：
- 避免复杂的软件依赖冲突
- 不同计算机之间更容易复现分析环境
- 不需要在本地安装大量依赖
- 方便后续扩展 QUAST、CheckM2、BUSCO 等分析
通过：
-i / --input
指定输入数据文件夹。
支持以下 FASTQ 格式：
.fastq.gz
.fq.gz
.fastq
.fq
例如：
datas/
├── sample1.fastq.gz
├── sample2.fastq.gz
└── sample3.fastq.gz
通过：
-o / --output
指定分析结果输出目录。
例如：
-o ./result主要结果会保存在该目录中。
查看帮助：
python3 proGAT.py -h基本运行方式：
python3 proGAT.py \
-i /path/to/input \
-o /path/to/output \
-d /path/to/database \
-t 48例如：
python3 proGAT.py \
-i ./datas \
-o ./result \
-d ./database \
-t 48| 参数 | 长参数 | 是否必填 | 默认值 | 说明 |
|---|---|---|---|---|
-i |
--input |
Yes | - | 输入 FASTQ 文件夹 |
-o |
--output |
Yes | - | 输出结果文件夹 |
-d |
--database |
No | ./database |
数据库根目录 |
-t |
--threads |
No | 8 |
使用线程数 |
SeqKit 用于快速统计原始测序数据的基本信息，例如：
- reads 数量
- 总碱基数
- 平均长度
- N50
- 最短 reads
- 最长 reads
示例：
seqkit stats sample.fastq.gz -a -T该步骤主要用于在正式分析前了解原始 ONT 数据的基本情况。
fastplong 用于 ONT 长读长测序数据的过滤和质量控制。
主要输出包括：
filtered.fastq.gz
HTML report
JSON report
过滤后的 FASTQ 数据会用于后续 LRGE 和 Flye 分析。
LRGE 用于根据长读长测序数据预测 genome size。
例如 LRGE 输出：
4426642
表示预测的 genome size 为：
4,426,642 bp
proGAT 会自动读取 LRGE 的预测结果，并将其传递给 Flye。
流程为：
FASTQ
|
v
LRGE
|
v
4426642 bp
|
v
Flye --genome-size 4426642
因此无需手动输入 Flye 的 genome size。
Flye 是本教程的主要基因组组装软件。
对于 ONT 高质量 reads，当前脚本使用：
--nano-hq
例如：
flye \
--nano-hq sample_filtered.fastq.gz \
--genome-size 4426642 \
--out-dir ./result/flye/sample \
--threads 48其中：
--genome-size 4426642
由 LRGE 自动预测并传入。
Flye 的主要组装结果为：
assembly.fasta
在完成 Flye 组装之后，可以继续使用以下软件评估 assembly：
- QUAST
- CheckM2
- BUSCO
这些步骤用于进一步评估：
- contig 数量
- genome size
- N50
- GC content
- Completeness
- Contamination
- BUSCO completeness
它们属于本教程中基因组组装后的扩展质量评估部分。
例如指定：
-o ./result输出目录大致为：
result/
├── seqkit_stats/
├── fastplong_filtered/
├── lrge/
├── flye/
├── quast/
├── checkm/
└── BUSCO/
其中最主要的组装结果位于：
result/flye/<sample>/assembly.fasta
当前教程主要面向：
- Oxford Nanopore Technologies（ONT）长读长测序
- 原核生物基因组
- bacterial genome assembly
- 初学者学习 ONT genome assembly workflow
核心分析流程为：
SeqKit
↓
fastplong
↓
LRGE
↓
Flye
后续可以在此基础上继续扩展：
- Kraken2 菌种鉴定
- 16S rRNA 鉴定
- QUAST
- CheckM2
- BUSCO
- Genome annotation
- Functional annotation